如是說999

 2017-06-27

  人类首次拍摄DNA复制过程，DNA复制方式遭改写

来源：iflscience

視頻來源:https://v.qq.com/x/page/c05160ymmho.html

视频内容

加州大学戴维斯分校的科学家们首次捕捉到DNA复制的镜头。此前人们一直认为，DNA聚合酶构建DNA双链的过程是相互协调以某种方式协同工作的。然而，这项新研究却有一些意外发现。有时候，一条单链会不可预测地停止延伸，而另一条单链还在持续；DNA复制的过程也会突然改变速率。这段视频表明，DNA复制的双链之间并无协调性，每条单链的合成都是完全独立的。这项研究为DNA复制的机制提供了新的见解。

【详细解读版】

美国加州大学戴维斯分校和斯隆凯特林癌症纪念中心的研究人员首次捕捉到单个DNA分子的复制过程。尽管这段11秒的视频看起来像是一款上个世纪的视频游戏，但它清楚地记录下DNA复制时散发荧光的单链由左向右延伸的过程。相关研究结果发表在2017年6月15日的《细胞》（Cell）期刊上，论文标题为“Independent and Stochastic Action of DNA Polymerases in the Replisome”。论文的通讯作者为加州大学戴维斯分校微生物学与分子遗传学教授Stephen Kowalczykowski和斯隆凯特林癌症纪念中心研究员Kenneth Marians。论文第一作者为加州大学戴维斯分校博士后研究员James Graham。敞开去接收就会有惊喜出现

利用复杂的成像技术和荧光染料，研究人员观察到来自大肠杆菌的单个DNA分子的复制，并且实时测量了DNA聚合酶完成这一过程的速度。

CREDIT: JAMES GRAHAM, UC DAVIS

DNA复制基础

DNA双螺旋是由方向相反的两条DNA单链组成的。每条单链都是由四种碱基（A、T、C和G）组成，并按照碱基互补配对原则形成DNA双链。

DNA开始复制时，解旋酶（helicase）首先将DNA双链解开为两条单链。而后，引发酶（primase）将引物附着到每条单链上，令DNA复制得以进行。随后，DNA聚合酶（polymerase）结合到引物上并沿着DNA单链移动，添加新的碱基以形成新的DNA双螺旋。

复制体（replisome）则是由解旋酶、引发酶和DNA聚合酶全酶组成的复合体。

由于DNA双螺旋中的两条单链方向相反，而DNA聚合酶只能定向的往前一个碱基的羟基后加上下一个碱基，因此DNA聚合酶在两条单链中的作用有别。在与复制叉（replication fork，即DNA双链解旋位置）移动方向一致的前导链（leading strand）中，DNA聚合酶能持续移动，在其身后形成一连串新的DNA双链。而在滞后链（lagging strand）中，由于复制方向相反，DNA聚合酶必须先结合到滞后链上并产生较短的双链DNA片段（即冈崎片段，Okazaki fragment）相当于一段引物，而后脱落下来再重新开始这一系列步骤。这一过程即DNA回环复制模型。

当前，人们普遍认为前导链和滞后链上的DNA聚合酶在某种程度上会进行配合，以至于一条单链的复制不会领先于另一条单链。

实验方法：滚环单分子测定（Rolling-Circle Single-Molecule Assay）

研究人员采用具有一段短末端的环状DNA片段进行实验，并将其附着到载玻片上。当复制体（replisome）绕着环状DNA片段滚动时，片段末端会变得更长。他们可通过添加或移除ATP（ATP是DNA复制启动所必须的）来开启或关闭DNA复制，并采用一种可结合双链DNA的荧光染料（SYTOX Orange）来观察复制过程。最终，整套装置都是在流动室中进行的，因此DNA链的延伸像是在微风中飘扬的旗帜一样。

 采用滚环单分子测定对前导链和滞后链的合成进行可视化。

 CREDIT: JAMES GRAHAM, UC DAVIS

研究亮点：停止、开始、变速

 CREDIT: JAMES GRAHAM, UC DAVIS

   在复制体中，负责合成前导链和滞后链的DNA聚合酶独立发挥功能。

   从动力学上来说，DNA复制是不连续的，期间会发生暂停和速率改变。

   当DNA合成暂停时，出于自我调节的失败-安全机制，解旋酶的速率会下降。

   滞后链DNA聚合酶再启动复制时的速率较持续合成能力减缓80%。

此前人们认为，在DNA复制时，复制体中负责前导链和滞后链复制的DNA聚合酶一定是相互协调的，以避免在新合成的链中出现明显的缺口。

该研究发现，复制体中的两个DNA聚合酶是独立发挥功能的。虽然DNA前导链和滞后链的平均复制速率相似，但两个DNA聚合酶各自的轨迹会呈现出随机地合成速率改变，期间还会发生明显的暂停。滞后链合成停止时，前导链的合成还会持续进行。这时发光的前导链上会出现黑暗区，因为研究使用的荧光染料不会附着到单链DNA上。

研究人员发现，解旋酶上存在着“自动制动器”，它能提前解开DNA双链。在DNA聚合酶暂停期间，解旋酶可能会继续解开双螺旋，这让DNA有一部分变成单链的状态，这种解链DNA很容易受到损伤。事实上，暴露出来的单链DNA会在细胞内发出一种警报信号来激活修复酶。

但基于自我调节机制，当解旋酶从复制体上脱落下来并开始远离复制体的剩余组分时，解旋酶速率会减缓80%。因此，解旋酶会缓慢地移动直到DNA聚合酶得以与其重新配合，随后解旋酶再次加速移动。

这些特征告诉我们，DNA复制是一个更为动态的不连续过程，复制体内各组分的联系会频繁地断开并重新形成。即使复制体内的各组分会出现随机行为，但仍能保证DNA复制的完整性，这一过程不需要前导链和滞后链的相互协调。

该研究的通讯作者Kowalczykowski表示，“这是一种真正的范式转移，颠覆了教科书中的许多内容。”

来源：iflscience

轉載自：http://mp.weixin.qq.com/s?timestamp=1498570867&src=3&ver=1&signature=CbqIopNmkMek67BWxorWhGv6JcsSrz4dIa7BjTdA-AhjGBwWe6IpSNlRwE2kUCdPtwr0lHhfsDCApv0Wm8vwuHFY-7AM82lJ68PfNaqe*d2-nE5HeB0GP1OhojaC2dW1WvZcnnDy6FTO8EGgFe86CsxX7O75yZ4UT1Rr5mzRbU8=

 （图文來自网络，版权属于原創）